Использование лиммы для дифференциального выражения с log2 Нормализованные данные RT-qPCR
Итак, у меня есть некоторые данные из эксперимента RTqPCR в разных образцах, измеряющие количество генов (80-90). Я предварительно обработал исходные данные Ct, исправляя их эффективность, нормализуя с помощью эталонных генов с помощью выбранных генов NormFinder и geNorm, усредняя технические повторы и вычисляя относительные количественные показатели, которые в конечном итоге были преобразованы в масштаб log2.
У меня есть одна матрица с данными log2 RTqPCR для нескольких генов в нескольких образцах, каждый для одной отдельной ткани для тех же самых анализируемых животных.
Ситуация заключается в том, что вместо вычисления простого t-критерия между двумя группами для оценки дифференциального выражения я хотел бы принять во внимание не только переменную группировки, но также другую факториальную переменную (пол) и непрерывную переменную, чтобы соответствовать многомерная регрессионная модель для анализа дифференциальных выражений.
Дело в том, что я использовал пакет limma для анализа данных Microarray ранее, и мне было интересно, будет ли правильным использовать преобразованные log2 матрицы для подгонки анализа дифференциальных выражений лиммы, а также как определить матрицу контраста и формулу для Линейная регрессия, если я хочу принять во внимание пол (фактор) и другие непрерывные переменные, кроме группы (две группы).
Мой файл фенотипа будет выглядеть примерно так:
Samples Sex Group Cont.Var
sample1 1 1 2.3
sample2 1 1 3.4
sample3 1 1 2.5
sample4 2 2 4.6
sample5 2 2 6.2
sample6 2 2 4.1
Какую формулу я должен определить в функции дизайна для создания контраста между группами 1 и 2? Скажем, я хотел бы сделать контраст между группами 1 и 2, принимая во внимание взаимодействие пола и Cont.Var с нормализованными данными log2 Ct.
Будет ли это другой подход или рекомендуемый конвейер для противопоставления этой гипотезы?
Большое спасибо